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Selecção de recombinantes Básico

Publicado em 13/12/2005 

Após a introdução de DNA recombinado (rDNA) em células de bactérias, a selecção de recombinantes é um passo essencial em Engenharia Genética, uma vez que, de entre as colónias originadas a partir de células transformadas, é necessário escolher aquelas onde o processo de clonagem de genes se deu com sucesso. Ou seja, há que seleccionar as colónias hospedeiras que contenham o DNA recombinado (rDNA) construído em laboratório e constituído pelo vector de clonagem com o fragmento de interesse inserido.

O processo de selecção pode ser feito, de forma directa, com base no ganho de resistência a um antibiótico (caso em que a marca de selecção do vector de clonagem é um gene que confere resistência a esse antibiótico) ou na capacidade de complementar uma auxotrofia (caso a marca do vector de clonagem é uma marca dita auxotrófica). A selecção pode ainda ser indirecta (usando placas réplica) se a estratégia utilizada se basear na perda de resistência a um composto inibidor do crescimento, em resultado da inactivação do gene que confere essa mesma resistência.

A selecção directa é feita de forma simples: ao espalhar-se a suspensão de células que foram sujeitas ao processo de transformação, em meio de cultura que contém um antibiótico, ou em meio mínimo (isto é, num meio de cultura que não contém um composto essencial que a célula não consegue sintetizar), só se originarão colónias resultantes de células resistentes a esse antibiótico ou que tenham a capacidade de se dividir neste meio mínimo. Esses novos fenótipos só podem ter duas origens: ou resultam do sucesso do processo de transformação (podendo as células conter o vector, com ou sem inserção), ou resultam de uma mutação espontânea em condições selectivas. Considerando esta última possibilidade é necessário recorrer a placas controlo que permitam avaliar a frequência de mutação espontânea. As células que são espalhadas nestas placas controlo não têm contacto o rDNA, embora sofram exactamente o mesmo tratamento que as células sujeitas a transformação. A possibilidade de se desenvolverem colónias nesta situação controlo resulta de mutações espontâneas, podendo a sua frequência ser avaliada e comparada com a frequência de aparecimento de potenciais células recombinante obtidas em resultado da transformação.

A selecção indirecta, pela técnica de placas réplica, permite fazer a selecção (negativa) das células que perderam a capacidade de, por exemplo, resistir a um dado antibiótico por o gene da marca de selecção ter sido interrompido com a introdução do DNA de interesse. A técnica consiste no seguinte:

  1. Num primeiro passo a cultura é inoculada em meio onde são capazes de crescer todas as células, as que contenham o vector de clonagem "vazio" ou o vector de clonagem com o fragmento de interesse;
  2. Num segundo passo, fazem-se duas placas réplica, em que uma mesma colónia é inoculada em meio com um segundo antibiótico (correspondente à segunda marca de selecção, aquela que terá sido inactivada caso a clonagem do gene tenha sido bem sucedida) e em meio sem esse antibiótico. Por comparação das duas placas,  é possível a selecção dos transformantes de interesse, que corresponderão ás colónias que existem em meio sem antibiótico (de onde são recuperadas), mas não em meio com antibiótico, visto que perderam essa capacidade em resultado da inserção do DNA de interesse.

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