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Hibridação e detecção de híbridos Básico

Publicado em 21/11/2005 

Hibridação

Estando preparada a membrana de nylon à qual se encontram ligados os fragmentos de DNA desnaturado, esta é incubada com um DNA heterólogo (que não tem qualquer relação com o DNA a sondar), tipicamente DNA de esperma de salmão. Este passo denomina-se pré-hibridação e o seu objectivo é reduzir a possibilidade de se darem hibridações não específicas entre o DNA a sondar e a sonda. Assim, durante  a hibridação (passo seguinte), a sonda substituirá o DNA heterólogo que se encontra a bloquear a membrana ao hibridar com a região de DNA à qual é hómologa, garantindo assim a formação de híbridos específicos, ou seja a especificidade dos sinais de hibridação.

Seguidamente, a membrana de nylon é mergulhada em tampão com o DNA da sonda e incubada durante várias horas para que se dê a hibridação, formando hibridos detectáveis devido à marcação da sonda (radioactiva ou não). Variáveis como a temperatura, o pH, a força iónica da solução de hibridação (concentração de sais), a sequência de bases e tamanho do fragmento usado como sonda determinam a velocidade da reacção de hibridação. Uma concentração elevada de sais, por exemplo, favorece as reacções de hibridação (i.e. menor especificidade e maior ruído de fundo), enquanto que uma concentração baixa de sais e/ou elevada temperatura aumenta a especificidade da reacção, reduzindo o ruído de fundo.

Estando formados os híbridos, o passo seguinte é de lavagem da membrana, durante o qual se removem restos de sonda e se desfazem ligações não específicas. O conceito de restringência é usado para referir a severidade das condições de lavagem. Quanto mais restringentes forem as condições usadas, maior será a especificidade da hibridação. A temperatura da lavagem, por exemplo, é determinada empiricamente tendo em conta o grau de homologia entre a sonda e o DNA alvo. Para sondas que apresentem uma homologia de 100 % com o DNA a sondar é habitual utilizarem-se temperaturas na ordem dos 65-75 ºC, eliminando assim eventuais hibridações não específicas. Se a sonda for pouco homóloga, convém começar-se a lavagem com uma temperatura baixa (37 ºC) que se vai aumentando em intervalos de 5 ºC, de modo a reduzir a manutenção de hibridações não específicas, conservando, no entanto, os sinais de hibridação específica. Também o tamanho da sonda é importante, pois verifica-se que, quando se usam sondas com menos de 100 pares de bases as lavagens têm de ser realizadas a temperaturas baixas, mesmo que a homologia seja de 100%; assim, as sondas devem ter mais de 100 pares bases de forma a que as moléculas híbridas sejam estáveis. No caso da utilização de um método não radioactivo, como o sistema biotina/estreptavidina, a detecção é feita por quimioluminescência.

No caso de se ter utilizado uma sonda marcada com nucleótidos radioactivos a detecção faz-se por exposição de uma chapa fotográfica à membrana. A figura em baixo mostra o resultado de uma experiência de hibridação de Southern. No painel da direita observam-se os sinais de hibridação obtidos com os milhares de fragmentos de restrição que foram separados por electroforese em gel de agarose (painel da esquerda). Só os fragmentos correspondentes aos sinais observados são hómologos da sonda de DNA usada nesta experiência.

HAN detecção

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