e-escola

Marcação da sonda Básico

Publicado em 21/11/2005 

O fragmento de DNA a usar como sonda na Hibridação de Southern pode resultar de um processo de clonagem de DNA  ou ser obtido por amplificação de DNA por PCR. A marcação pode ser efectuada por métodos químicos ou enzimáticos e ser directa ou indirecta. A marcação directa consiste na ligação à molécula de ácido nucleico de um grupo chamado repórter, gerador de um sinal detectável. Os exemplos mais comuns de grupos repórter usados para marcação directa são o 32P ou 35S, presentes em nucleótidos radioactivos. A construção da sonda envolve a ressíntese, in vitro, da sua sequência de nucleótidos na presença destes nucleótidos assim marcados.

O desenvolvimento mais recente de métodos que permitem preparar sondas marcadas não radioactivamente veio tornar possível o uso de métodos de hibridação de ácidos nucleicos em análises de rotina. Neste caso, a marcação indirecta consiste na ligação à sonda de um grupo modificador ao qual, no processo de detecção de híbridos, se irá ligar um conjunto formado por duas moléculas: um anticorpo específico para o grupo modificador, ligado a um grupo repórter que possibilita a detecção do hibrido. Um exemplo comum é o sistema biotina/estreptavidina no qual o grupo modificador é a biotina, o papel de anticorpo é desempenhado pela  estreptavidina, que tal como a avidina se liga forte e especificamente à biotina,  e o grupo repórter é uma enzima que actua sobre um  substrato cromogéneoGlossário.

Exemplo de uma estratégia para marcação de sondas de DNA

A estratégia de marcação de sondas usada para a utilização do sistema biotina/estreptavidina é um método indirecto não radioactivo. Consiste na marcação de nucleótidos com a vitamina biotina e incorporação desses nucleótidos na sonda usando random primer labelling (ou seja, marcação usando iniciadores aleatórias). Neste método, após a desnaturação do DNA por calor, este é incubado com um mistura de oligonucleótidos de sequência escolhida aleatoriamente (10-20 resíduos). Durante o arrefecimento os oligonucleótidos emparelham com os diversos locais das cadeias de DNA que sejam complementares, funcionando depois como iniciadores para a síntese da cadeia complementar por recurso ao  fragmento de KlenowGlossário da DNA polimerase. Os nucleótidos (ou parte deles) incorporados contêm biotina.

Autor e Créditos

Autor:

 

Para comentar tem de estar registado no portal.

Esqueceu-se da password?

© 2008-2009, Instituto Superior Técnico. Todos os direitos reservados.
  • Feder
  • POS_conhecimento