Marcação da sonda Básico
Publicado em 21/11/2005
O fragmento de DNA a usar como sonda na Hibridação de Southern pode resultar de um processo de clonagem de DNA ou ser obtido por amplificação de DNA por PCR. A marcação pode ser efectuada por métodos químicos ou enzimáticos e ser directa ou indirecta. A marcação directa consiste na ligação à molécula de ácido nucleico de um grupo chamado repórter, gerador de um sinal detectável. Os exemplos mais comuns de grupos repórter usados para marcação directa são o 32P ou 35S, presentes em nucleótidos radioactivos. A construção da sonda envolve a ressíntese, in vitro, da sua sequência de nucleótidos na presença destes nucleótidos assim marcados.
O desenvolvimento mais recente de métodos que permitem preparar
sondas marcadas não radioactivamente veio tornar possível o uso de
métodos de hibridação de ácidos nucleicos em análises de rotina.
Neste caso, a marcação indirecta consiste na ligação à sonda de um
grupo modificador ao qual, no processo de detecção de híbridos, se irá
ligar um conjunto formado por duas moléculas: um anticorpo específico
para o grupo modificador, ligado a um grupo repórter que possibilita a
detecção do hibrido. Um exemplo comum é o sistema
biotina/estreptavidina no qual o grupo modificador é a biotina, o papel
de anticorpo é desempenhado pela estreptavidina, que tal como a
avidina se liga forte e especificamente à biotina, e o grupo
repórter é uma enzima que actua sobre um
substrato cromogéneo
.
Exemplo de uma estratégia para marcação de sondas de DNA
A estratégia de marcação de sondas usada para a utilização do
sistema biotina/estreptavidina é um método indirecto não radioactivo.
Consiste na marcação de nucleótidos com a vitamina biotina e
incorporação desses nucleótidos na sonda usando random primer labelling (ou
seja, marcação usando iniciadores aleatórias). Neste método, após a
desnaturação do DNA por calor, este é incubado com um mistura de
oligonucleótidos de sequência escolhida aleatoriamente (10-20
resíduos). Durante o arrefecimento os oligonucleótidos
emparelham com os diversos locais das cadeias de DNA que
sejam complementares, funcionando depois como iniciadores para a
síntese da cadeia complementar por recurso ao
fragmento de Klenow da DNA polimerase. Os nucleótidos (ou parte deles) incorporados contêm biotina.
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