e-escola

Preparação e transferência do DNA a sondar Básico

Publicado em 21/11/2005 

Preparação do DNA

De uma forma geral, a experiência de hibridação inicia-se com a extracção do DNA em que se pretende sondar a presença de um exemplo no DNA total de uma estirpe bacteriana. Incuba-se o DNA a sondar com uma enzima de restrição e separam-se os fragmentos obtidos por electroforese em gel de agarose. Após separação electroforética, o gel obtido é fotografado sob luz UV e, após desnaturação dos ácidos nucleicos, é transferido para uma membrana, por exemplo, de nylon.

Após electroforese, o DNA é desnaturado, geralmente com uma base forte (por exemplo: solução de NaOH 0,5 M). O passo de desnaturação é essencial uma vez que os fragmentos terão que estar em cadeia simples para posterior hibridação com a sonda.

Após neutralização do pH do gel, este é transferido para uma membrana, por exemplo de nylon (ver figuras). Para tal, o gel é colocado sobre um papel de filtro que se encontra em contacto com uma solução tampão. Em cima do gel são colocados, por esta ordem, uma membrana de nylon, uma camada de folhas de papel absorvente e um objecto pesado. Desta forma, a solução tampão passa, por capilaridade, para as folhas de papel, atravessando o gel e eluíndo o DNA. Obtemos assim uma réplica do gel na membrana de nylon, uma vez que os fragmentos de ácido nucleico têm nesta a mesma organização que tinham no gel. A fixação dos fragmentos de DNA à membrana é feita por irradiação com luz UV, que promove o crosslinking (ligação covalente) entre ácidos nucleicos e nylon.

HAN trans 1
HAN trans 2
HAN trans 3

Autor e Créditos

Autor:

 

Para comentar tem de estar registado no portal.

Esqueceu-se da password?

© 2008-2009, Instituto Superior Técnico. Todos os direitos reservados.
  • Feder
  • POS_conhecimento