Exemplo de utilização Básico
Publicado em 18/11/2005
Na figura apresenta-se um exemplo da detecção de sequências específicas de DNA, integrado numa experiência onde se pretendeu identificar e descobrir a organização do conjunto de genes involvidos na biossíntese de um
exopolissacárido
por bactérias pertencentes ao complexo Burkholderia cepacia (saber mais). Para investigar o pretendido, a estratégia seguida passou pela construção de mutantes que não produzissem o exopolissacárido, usando uma estratégia de mutagénese aleatória por plasposões. Para tal:
- o plasposão foi mobilizado de uma estirpe de E.coli, dadora, para uma estirpe de B.cepacia, receptora, por conjugação triparental usando uma segunda estirpe de E. coli como estirpe ajudante. O plasposão, uma vez no interior das células receptoras, insere-se aleatoriamente no genoma destas;
- proporcionou-se o crescimento de colónias e procuraram-se colónias não produtoras do exopolissacárido, que corresponderão a mutantes onde o plasposão se inseriu, presumivelmente num dos genes responsáveis pela produção deste;
- Confirmaram-se que as colónias dos mutantes seleccionados, de facto, tinham o plasposão inserido no seu genoma.
Para levar a cabo a tarefa 3, realizaram-se experiências de hibridação de Southern em que a sonda utilizada é parte da sequência que queremos detectar, ou seja, é parte da sequência do plasposão que se tentou inserir no genoma. A figura apresentada é uma autoradiografia da membrana de nylon resultante da experiência de Southern. Nesta figura pode identificar-se, na primeira pista, o DNA padrão. Nas pistas seguintes observa-se apenas uma banda de hibridação em cada pista, onde existiam milhares de fragmentos de restrição resultantes da acção de uma enzima de restrição sobre o DNA genómico e que foram separadas por electroforese em gel de agarose. Por essa razão, considera-se que o genoma dos mutantes inspeccionados apresentam o plasposão inserido em apenas um local do genoma, sendo esse diferente de mutante para mutante.
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