e-escola

Proteómica quantitativa - abordagem experimental Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

Em proteómica quantitativa, uma das técnicas base mais utilizadas para a separação de proteínas é a electroforese a duas dimensões (2-D). Na electroforese2 Tooltip , as proteínas em solução são separadas com base em duas das suas propriedades: numa primeira dimensão, de acordo com o seu ponto isoeléctrico Glossário (pI) e, numa segunda dimensão, em gel de SDS-PAGE, de acordo com o seu peso molecular (MW). Ou seja, a electroforese 2-D resulta da combinação de duas técnicas: a focagem isoeléctrica Glossário (IEF- Iso Electric Focusing), seguida de uma separação por SDS-PAGE. Quando bem sucedida, obtém-se um gel de poliacrilamida contendo numerosos spots, bem separados, cada um correspondendo a uma proteína (ou a uma forma proteica), como ilustrado na figura abaixo que permite comparar a separação obtida por SDS-PAGE (à esquerda) e por electroforese bi-dimensional (à direita).

PQ 1

Os fundamentos desta abordagem foram apresentados, pela primeira vez, por O’Farrell e Klose em 1975 (O'Farrell, 1975Link externo; Klose, 1975Link externo). Desde então, têm-se verificado melhoramentos substanciais na qualidade e reproductibilidade dos resultados obtidos, em consequência do desenvolvimento de equipamentos e reagentes específicos. Hoje em dia, a aplicação da electroforese 2-D permite uma alta resolução das várias espécies proteicas presentes numa amostra biológica, de uma forma reproductível.

Para além da sua alta resolução e reproductibilidade, a electroforese 2-D permite também separar as várias formas proteicas que tenham sofrido modificações pós-tradução. A separação destas formas é possível visto que essas modificações conferem propriedades diferentes à proteína, em particular, um diferente ponto isoeléctrico ou peso molecular. Por exemplo, consegue-se distinguir as formas  fosforilação Glossário e não-fosforilada das fosfo-proteínas porque este tipo de modificação pós-tradução implica uma alteração do seu pI e peso molecular. Pode-se avaliar a presença de proteínas fosforiladas num proteoma dividindo a amostra proteica em duas alíquotas, e tratando uma delas com uma fosfatase, para remoção dos grupos fosfato. Por comparação dos mapas obtidos após separação por electroforese bi-dimensional das amostras, tratada e não tratada, é possível identificar as proteínas que se encontram fosforiladas, uma vez que a perda do grupo fosfato resulta na sua migração para zonas mais básicas do gel, durante a focagem isoeléctrica (Yamagata et al., 2002Link externo). Modificações do tipo  acetilação Glossário , glicosilação Glossário ou hidrólise específica de determinados péptidos, alteram o peso molecular da proteína modificada e, eventualmente, o seu pI, tornando assim possível a detecção dessas formas com base nos géis 2-D.

Em estudos de proteómica quantitativa, a análise comparativa dos proteomas obtidos em duas (ou mais) situações em estudo, tem por objectivo identificar e quantificar as possíveis alterações ao nível da abundância relativa de cada espécie proteica separada nos géis 2-D. Desta forma, torna-se possível identificar as proteínas envolvidas na resposta celular à alteração imposta. Geralmente, é construído um mapa de referência do proteoma de células cultivadas na condição de referência. Este mapa de referência é construído através da catalogação das várias espécies proteicas separadas em géis 2-D, após a sua identificação.

Em termos experimentais, os vários passos da análise global por proteómica quantitativa, utilizando a electroforese 2-D como técnica de separação, estão representados no esquema seguinte. Podemos ainda consultar o procedimento experimental.

Autor e Créditos

Autor:

 

Para comentar tem de estar registado no portal.

Esqueceu-se da password?

© 2008-2009, Instituto Superior Técnico. Todos os direitos reservados.
  • Feder
  • POS_conhecimento