PCR - Procedimento Experimental
Equipamento e reagentes necessários para efectuar uma reacção
de amplificação de DNA
- Um termociclador;
- Microtubos de 200 µL;
- Um par de oligonucleótidos (iniciadores), os
quatro trifosfato de nucleósido (ATP, GTP, CTP, TTP), DNA molde, tampão
contendo magnésio magnésio, uma polimerase.
Procedimento Experimental
- Por cada reacção de amplificação (ver Tabela I), colocar em
microtubos o DNA alvo, sendo recomendado de 1 a 250 ng para DNA
bacteriano e de 0,1 a 500 ng para DNA plasmídico.
- De seguida, adicionar 2 µl da solução de cada iniciador, 1 µl de
mistura de nucleótidos (10 mM), 1,5 µl de MgCl2 (50 mM) e 5 µl do
respectivo tampão de enzima (10x). Perfazer o volume final da mistura
reaccional a 50 µl com água destilada estéril.
- Imediatamente antes de se iniciar a reacção de PCR, adicionar a cada microtubo 2,5U da enzima Taq DNA polimerase.
- Colocar os microtubos no termociclador dando-se início ao programa seleccionado.
- Após finalização do programa, retirar os tubos do aparelho de PCR
e proceder a uma separação electroforética
ou colocá-los a -20ºC até
posterior utilização.
Quantidades de cada reagente a usar numa reacção de amplificação de DNA para um volume final de 50 µl |
Reagente |
Volume |
Concentração final |
Água |
Variável |
|
Mistura de dNTPs 10 mM |
1 µl |
cada dNTP 200 µM |
Par de iniciadores |
2µl |
0,2 µM cada |
DNA alvo |
Variável |
0,1-0,25 m g |
Tampão da enzima 10x |
5 µl |
1x |
MgCl 2 |
1,5 µl |
1,5 mM |
Polimerase (U/ µl) |
0,5 µl |
2,5 unidades |
Programa típico |
Reagente |
Volume |
Concentração final |
Água |
Variável |
|
Mistura de dNTPs 10 mM |
1 ml |
cada dNTP 200 mM |
Par de iniciadores |
2ml
2ml |
0,2 mM cada |
DNA alvo |
Variável |
0,1-0,25 mg |
Tampão da enzima 10x |
5 ml |
1x |
MgCl 2 |
1,5 ml |
1,5 mM |
Polimerase (U/µl) |
0,5 ml |
2,5 unidades |
*A temperatura de ligação dos iniciadores depende da sua temperatura de fusão.
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