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Técnica de PCR Básico

Publicado em 21/11/2005 

PCR - Procedimento Experimental

Equipamento e reagentes necessários para efectuar uma reacção de amplificação de DNA

  • Um termociclador;
  • Microtubos de 200 µL;
  • Um par de oligonucleótidos (iniciadores), os quatro trifosfato de nucleósido (ATP, GTP, CTP, TTP), DNA molde, tampão contendo magnésio magnésio, uma polimerase.
Procedimento Experimental
  1. Por cada reacção de amplificação (ver Tabela I), colocar em microtubos o DNA alvo, sendo recomendado de 1 a 250 ng para DNA bacteriano e de 0,1 a 500 ng para DNA plasmídico.
  2. De seguida, adicionar 2 µl da solução de cada iniciador, 1 µl de mistura de nucleótidos (10 mM), 1,5 µl de MgCl2 (50 mM) e 5 µl do respectivo tampão de enzima (10x). Perfazer o volume final da mistura reaccional a 50 µl com água destilada estéril.
  3. Imediatamente antes de se iniciar a reacção de PCR, adicionar a cada microtubo 2,5U da enzima Taq DNA polimerase.
  4. Colocar os microtubos no termociclador dando-se início ao programa seleccionado.
  5. Após finalização do programa, retirar os tubos do aparelho de PCR e proceder a uma separação electroforética ou colocá-los a -20ºC até posterior utilização.
PCR 3
Quantidades de cada reagente a usar numa reacção de amplificação de DNA para um volume final de 50 µl
Reagente Volume Concentração final
Água Variável  
Mistura de dNTPs 10 mM 1 µl cada dNTP 200 µM
Par de iniciadores 2µl 0,2 µM cada
DNA alvo Variável 0,1-0,25 m g
Tampão da enzima 10x 5 µl 1x
MgCl 2 1,5 µl 1,5 mM
Polimerase (U/ µl) 0,5 µl 2,5 unidades
Programa típico
Reagente Volume Concentração final
Água Variável  
Mistura de dNTPs 10 mM 1 ml cada dNTP 200 mM
Par de iniciadores 2ml
2ml
0,2 mM cada
DNA alvo Variável 0,1-0,25 mg
Tampão da enzima 10x 5 ml 1x
MgCl 2 1,5 ml 1,5 mM
Polimerase (U/µl) 0,5 ml 2,5 unidades

*A temperatura de ligação dos iniciadores depende da sua temperatura de fusão.

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