Técnica de PCR Básico
Publicado em 21/11/2005
PCR - Procedimento Experimental
Equipamento e reagentes necessários para efectuar uma reacção de amplificação de DNA
- Um termociclador;
- Microtubos de 200 µL;
- Um par de oligonucleótidos (iniciadores), os quatro trifosfato de nucleósido (ATP, GTP, CTP, TTP), DNA molde, tampão contendo magnésio magnésio, uma polimerase.
Procedimento Experimental
- Por cada reacção de amplificação (ver Tabela I), colocar em microtubos o DNA alvo, sendo recomendado de 1 a 250 ng para DNA bacteriano e de 0,1 a 500 ng para DNA plasmídico.
- De seguida, adicionar 2 µl da solução de cada iniciador, 1 µl de mistura de nucleótidos (10 mM), 1,5 µl de MgCl2 (50 mM) e 5 µl do respectivo tampão de enzima (10x). Perfazer o volume final da mistura reaccional a 50 µl com água destilada estéril.
- Imediatamente antes de se iniciar a reacção de PCR, adicionar a cada microtubo 2,5U da enzima Taq DNA polimerase.
- Colocar os microtubos no termociclador dando-se início ao programa seleccionado.
- Após finalização do programa, retirar os tubos do aparelho de PCR e proceder a uma separação electroforética ou colocá-los a -20ºC até posterior utilização.
| Quantidades de cada reagente a usar numa reacção de amplificação de DNA para um volume final de 50 µl | ||
|---|---|---|
| Reagente | Volume | Concentração final |
| Água | Variável | |
| Mistura de dNTPs 10 mM | 1 µl | cada dNTP 200 µM |
| Par de iniciadores | 2µl | 0,2 µM cada |
| DNA alvo | Variável | 0,1-0,25 m g |
| Tampão da enzima 10x | 5 µl | 1x |
| MgCl 2 | 1,5 µl | 1,5 mM |
| Polimerase (U/ µl) | 0,5 µl | 2,5 unidades |
| Programa típico | ||
|---|---|---|
| Reagente | Volume | Concentração final |
| Água | Variável | |
| Mistura de dNTPs 10 mM | 1 ml | cada dNTP 200 mM |
| Par de iniciadores | 2ml 2ml |
0,2 mM cada |
| DNA alvo | Variável | 0,1-0,25 mg |
| Tampão da enzima 10x | 5 ml | 1x |
| MgCl 2 | 1,5 ml | 1,5 mM |
| Polimerase (U/µl) | 0,5 ml | 2,5 unidades |
*A temperatura de ligação dos iniciadores depende da sua temperatura de fusão.
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