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Clonagem de genes por recombinação homóloga ("gap-repair") Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

Clonagem de genes eliminados por recombinação hómologa ("gap-repair")

A análise do fenótipo que as estirpes mutadas por eliminação individual dos diversos genes da levedura pode ser revelador da função biológica de cada gene eliminado. No entanto, a confirmação da função desse mesmo gene passa pela confirmação da reposição do fenótipo da célula original, utilizando um plasmídeo recombinado a partir do qual seja possível exprimir, nas células do mutante com o gene eliminado esse mesmo gene funcional. A construção deste plasmídeo recombinado com o gene em questão inserido  pode ser realizada recorrendo à técnica denominada de "Gap Repair" que utiliza a própria cassete de eliminação com vista a  introduzir o gene completo no vector de clonagem. Na levedura, esta técnica pode ser realizada por recombinação hómologa, uma vez que este processo é altamente eficiente neste organismo.

Bio, EG, MAEG, CPRCGE

Recorre-se pois a um vector de clonagem onde se encontra inserida a cassete ladeada pelas respectivas zonas de homologia com o gene em questão. Faz-se a restrição deste plasmídeo com uma enzima (no presente exemplo, a enzima NotI) que corta o DNA nos locais fronteira entre o módulo KanMX e as regiões de homologia flanqueantes, obtendo-se assim um plasmídeo linearizado, sem a cassete mas mantendo as duas regiões de homologia. O plasmídeo é introduzido em células de levedura que contêm o gene funcional. Nelas, por recombinação hómologa entre as regiões flanqueantes do gene que são hómologas às presentes no  plasmídeo linearizado há reconstrução do gene no plasmídeo, como se mostra na figura acima. Se o  plasmídeo construído desta forma for inserido nas células da estirpe mutante, onde este gene foi eliminado, repondo assim a falha criada, é possível verificar se há ou não reposição do fenótipo correspondente à função biológica do gene.

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