e-escola

Eliminação de vários genes (múltipla) Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

Eliminação sistemática de vários genes

A utilização de cassetes de eliminação revela-se eficiente quando se pretende eliminar um gene individualmente. No entanto, em determinadas circunstâncias, pode haver necessidade de se eliminar simultaneamente uma série de genes (eliminação múltipla). Por exemplo, no caso de genes homólogos que codificam para proteínas com a mesma funcionalidade (por exemplo,  transportadores membranaresGlossário), se apenas se eliminar um desses genes poderá não haver alteração do fenótipo, uma vez que as outras proteínas transportadoras se encontram funcionais e podem, eventualmente, substituir a proteína eliminada. A forma de se resolver a situação é construir dois tipos de mutantes: num deles eliminam-se todos os genes homólogos excepto o que se pretende estudar, enquanto que no outro tipo de mutante são eliminados todos os genes homólogos inclusivé o gene que se pretende estudar. Por comparação do fenótipo, dos dois mutantes é possível obter pistas sobre a função do gene alvo.

A questão que agora se coloca é como efectuar eliminações sucessivas de vários genes utilizando uma mesma cassete de eliminação. Como já foi referido, a introdução da primeira cassete no cromossoma(saber mais)faz com que as células mutadas se tornem resistentes à geneticina. A utilização de uma segunda cassete para eliminar um segundo gene exigiria a utilização duma cassete com uma marca de selecção diferente da primeira e, assim sucessivamente, tantas fossem as vezes necessárias para eliminar todos os genes pretendidos. No entanto, principalmente na construção de mutantes múltiplos com um elevado número de genes eliminados, este aspecto pode constituir uma limitação à técnica. Para ultrapassar esta limitação Güldener e colaboradores (1996) Link externo desenvolveram uma técnica alternativa em que é possível retirar a cassete KanMX a voltar a utilizá-la tantas vezes quantas necessárias. De cada lado da cassete KanMX foram para isso introduzidas duas pequenas sequências designadas LoxP. Após a utilização desta cassete para a eliminação de um gene e após a verificação da sua correcta inserção no genoma, as células de levedura são transformadas com um plasmídeo, o pSH47 (Güldener et al., 1996), que contém a sequência codificante da  recombinaseGlossário Cre, sob a regulação de um promotor (Gal1) que é activado pela presença da galactose (saber mais).

ESG

Ao cultivar as células de levedura em meio de crescimento contendo como fonte de carbono galactose em vez de glucose, a recombinase Cre é expressa e vai promover a recombinação entre os dois locais LoxP, e a consequente excisão da cassete de eliminação KanMX existente entre eles (Figura). As células de levedura, anteriormente resistentes a geneticina passam a ser de novo sensíveis a este antibiótico. Além da alteração do fenótipo, é possível confirmar a perda do módulo KanMX recorrendo a um PCR de verificação, sobre a região do DNA em causa.

Antes de proceder a uma nova eliminação, recorrendo de novo à cassete loxP-KanMX-loxP é essencial que o plasmídeo pSH47 seja perdido das células de levedura .

Autor e Créditos

Autor:

 

Para comentar tem de estar registado no portal.

Esqueceu-se da password?

© 2008-2009, Instituto Superior Técnico. Todos os direitos reservados.
  • Feder
  • POS_conhecimento