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Eliminação de um gene com recurso a uma cassete de eliminação Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

A eliminação de um determinado gene no genoma é uma estratégia muito útil para estudar a função biológica desse mesmo gene na célula. A eliminação de um gene e a subsequente análise da alteração do seu fenótipoGlossário original é uma prática levada a cabo com sucesso na levedura Saccharomyces cerevisiae, com  base na recombinação homóloga, um mecanismo que ocorre naturalmente in vivo. Nesta leveduraTooltip este processo é extremamente eficiente o que permite a obtenção, com facilidade, dos mutantes com o gene pretendido eliminado.

Na eliminação individual e sistemática  de genes de levedura, cada gene a eliminar é substituído por um fragmento de DNA exógeno que se designa cassete de eliminação. Por exemplo, é possível utilizar com sucesso a cassete KanMX (Wach et al., 1994 Link externo) ( DNA de uma bactéria à qual confere resistência à canamicina - Kanr) e que confere resistência ao antibiótico geneticina quando expressa na levedura.

Eliminação de genes c cassetes

Para levar a cabo o processo de recombinação homóloga de forma eficiente, a cassete tem que ser flanqueada por regiões de DNA homólogas ao gene ou com a vizinhança do gene que se pretende eliminar (saber mais). Assim, para cada gene a eliminar  são desenhadas sequências de homologia específicas. Como o genoma de Saccharomyces cerevisiae está sequenciado, caso a eliminação seja realizada na estirpe sequenciada é possível desenhar estas zonas flanqueantes de modo a compreenderem apenas cerca de 40 pares de bases para que o processo seja eficiente, já que elas podem ser desenhadas de modo a terem 100% hómologas do gene alvo. No entanto, para estirpes diferentes da estirpe sequenciada, para a qual se conhece perfeitamente a sequência da região de interesse, nomeadamente no caso de estirpes industriais, há necessidade de utilizar regiões de homologia mais extensas (cerca de 400 a 700 pares de bases) de forma a aumentar a probabilidade de ocorrer recombinação homóloga  no local do genoma pretendido.(saber mais)

Uma vez construída a cassete de eliminação, esta é introduzida nas células de Saccharomyces cerevisiae por transformação. No interior das células ocorre recombinação homóloga entre as zonas de homologia da cassete e as regiões correspondentes do gene alvo. Desta forma a cassete insere-se no genoma substituíndo grande parte do gene e conduzindo à perda da sua funcionalidade (Figura).

A selecção das células que incorporaram a cassete no seu genoma é um passo essencial para a obtenção dos mutantes com o gene eliminado. Como a expressão da cassete KanMX confere resistência ao antibiótico geneticina em levedura é esta característica que vai permitir a identificação das células que possuem o gene eliminado. Assim, em meio de cultura suplementado com antibiótico apenas vão crescer as células com a cassete inserida no genoma (mutantes com o gene eliminado)  porque só esses vão expressar a resistência à geneticina.

O DNA da cassete de eliminação é DNA heterólogo, mais precisamente, de origem bacteriana. Assim, a probabilidade de que existam outros locais no genoma com sequências de homologia com o DNA da cassete,  para além daquelas que foram seleccionadas a partir da sequência do gene alvo é muito reduzida. No entanto, é sempre necessário proceder à confirmação do local exacto de inserção da cassete, recorrendo à amplificação de DNA por PCR e seguida da análise dos produtos de amplificação obtidos. (Saber mais)

O facto da recombinação homóloga ser um processo muito eficiente em S. cerevisiae tornou possível a construção de bancos de mutantes haplóidesGlossáriodiplóides heterozigóticosGlossário com cada um dos cerca de 6000 genes individualmente eliminados. Esse trabalho, realizado no âmbito do projecto EUROSCARF Link externo envolveu diversos laboratórios, a nível mundial, com o objectivo de acelerar a análise funcional de novos genes, ou seja, a atribuição de uma função biológica a genes cuja existência se desconhecia anteriormente à análise in silico (no computador, usando ferramentas da bioinformática) da sequência completa do genoma.

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