Obtenção de mutantes não produtores de exopolissacárido Avançado
Publicado em 18/11/2005
Estratégia para a obtenção de mutantes não produtores do EPS cepaciano
Com o objectivo de obter mutantes de B. cepacia não
produtores do exopolissacárido cepaciano utilizou-se
a denominada mutagénese por recurso a transposões.
Neste caso particular, usou-se o TnMod-OKm (figura 1). Este
transposão
está
contido num plasmídeo de
gama estreita de hospedeiros capaz de replicar somente
em Escherichia coli.
Possui as regiões denominadas "inverted repeats" do transposão
Tn5 e entre elas encontra-se, para além da origem de replicação oriR
proveniente do plasmídeo pMB1, o gene que codifica uma proteína com
actividade de aminoglucósido fosfotransferase e que confere
resistência ao antibiótico canamicina.
Fora desta região, encontra-se a origem de transferência (oriT) do
plasmídeo conjugativo RP4 e o gene que codifica para a transposase do
Tn5 (figura 1). Pelo facto de a sequência contida entre as "inverted
repeats" conter uma origem de replicação, este transposão denomina-se
plasposão.
Fig. 1
A estratégia para a obtenção de mutantes de B. cepacia não produtores de cepaciano encontra-se representada na figura 2. Mobilizou-se, através do processo de conjugação triparental, o plasposão pTnMod-Okm de E. coli para a estirpe produtora de exopolissacárido B. cepacia IST408. Os transconjugantes foram seleccionados em meio S suplementado com canamicina e as colónias com aparência menos mucosa foram repicadas para novas placas.
Para determinar quais das colónias perderam efectivamente a capacidade de produzir exopolissacárido foi efectuada uma coloração com o corante lipofílico negro de sudão. As colónias que não incorporaram o corante foram seleccionadas e confirmada a ausência de exopolissacárido em meio S. Na figura 2, podem observar-se duas placas de Petri, uma delas com colónias da estirpe produtora B. cepacia IST408, com aspecto altamente mucoso, e a outra de um seu mutante isogénico, não produtor de exopolissacárido, obtido numa experiência idêntica à descrita anteriormente.
Fig. 2 - Representação das várias etapas efectuadas para a obtenção de mutantes de B. cepacia deficientes na produção do exopolissacárido cepaciano.
Através desta estratégia, foi possível obter seis mutantes não produtores de cepaciano, denominados IST408-SS1, IST408-SS2, IST408-SS3, IST408-SS4, IST408-SS5 e IST408-SS6.
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