Selecção e desenho de iniciadores ("primers") para Engenharia Genética da levedura Intermédio
Publicado em 18/11/2005 (revisto em 16/09/2010)
Síntese
Exemplificação do uso da base de dados Saccharomyces Genome (SGD) dedicada à levedura Saccharomyces cerevisiae, a partir de um problema biológico centrado na análise funcional do gene FLR1 (ORF YBR008c). Construção da cassete de eliminação a partir de plasmídeos, recorrendo à técnica de amplificação por PCR.
Palavras-chave
- SGD
- Saccharomyces cerevisiae
- gene FLR1
- cassete de eliminação
- plasmídeos
- amplificação por PCR
Objectivos de aprendizagem
A aprendizagem neste tópico envolve os seguintes objectivos:
- Experimentar a utilização da base de dados Saccharomyces Genome (SGD), a partir de um problema biológico centrado na análise funcional do gene FLR1 (ORF YBR008c);
- Caracterizar o processo de construção da cassete de eliminação a partir de plasmídeos, recorrendo à técnica de amplificação por PCR.
Com o objectivo de exemplificar o uso da base de dados Saccharomyces
Genome Database
(SGD)
dedicada à levedura Saccharomyces cerevisiae seleccionou-se
um problema biológico centrado na análise funcional do gene FLR1 (ORF
YBR008c). Este gene foi assim denominado com base na sua capacidade
para conferir à levedura resistência contra o importante
fungicida de uso clínico fluconazole.
O gene FLR1 codifica uma
proteína, presente na membrana plasmática, que pertence à família dos
transportadores de múltiplas drogas da super-família de facilitadores
maioritários (MFS, de Major Facilitator Superfamily,
Sá-Correia
e Tenreiro, 2002).
Por isso, prevê-se que esta esteja a promover a expulsão activa,
de dentro da célula, de compostos inibidores do crescimento,
estruturalmente e funcionalmente não relacionados, num antiporte com
protões, energizado pelo potencial electroquímico transmembranar.
Deste modo, a proteína FLR1p é responsável pela redução da concentração intracelular de fluconazole (e de vários outros compostos tóxicos), garantindo assim uma maior tolerância da levedura a estes compostos.
A eliminação do gene FLR1 do genoma de S. cerevisiae, por recurso a uma cassete de eliminação pressupõe a selecção de material biológico com base em ferramentas de bioinformática e a informação biológica disponível na SGD. Esse mutante Δflr1 pode depois ser usado para tentar esclarecer a função biológica do gene eliminado.
Foi com base em testes de susceptibilidade deste mutante a diversos compostos tóxicos que se demonstrou a sua função como determinante de resistência a alguns desses compostos.
Como DNA molde para PCR usou-se o plasmídeo
pFA6-KanMX4 (Wach
et al., 1994)
que inclui a cassete
de eliminação, KanMX4.
Fig. 1 - Esquema representativo do mapa físico do plasmídeo pFA6-KanMX4, usado como molde na reacção de PCR, realizada para obter as cassetes de eliminação SFH. Estão assinaladas as posições relativas dos iniciadores de PCR usados para proceder à verificação por PCR dos mutantes de eliminação.
Este módulo contém ainda o transposão 
Tn903
kanr de E. coli fundido com o promotor e o
terminador do factor de elongação da tradução do fungo Ashbya gossypii (Ag
TEF).
A expressão de KanMX4 confere resistência à canamicina em E. coli enquanto que em levedura (naturalmente resistente à canamicina) confere resistência a geneticina.
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