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Selecção e desenho de iniciadores ("primers") para Engenharia Genética da levedura Intermédio

Publicado em 18/11/2005 (revisto em 16/09/2010)

Ficha de Aprendizagem

Síntese

Exemplificação do uso da base de dados Saccharomyces Genome (SGD) dedicada à levedura Saccharomyces cerevisiae, a partir de um problema biológico centrado na análise funcional do gene FLR1 (ORF YBR008c). Construção da cassete de eliminação a partir de plasmídeos, recorrendo à técnica de amplificação por PCR.

Palavras-chave
  • SGD
  • Saccharomyces cerevisiae
  • gene FLR1
  • cassete de eliminação
  • plasmídeos
  • amplificação por PCR
Objectivos de aprendizagem

A aprendizagem neste tópico envolve os seguintes objectivos:

  • Experimentar a utilização da base de dados Saccharomyces Genome (SGD), a partir de um problema biológico centrado na análise funcional do gene FLR1 (ORF YBR008c);
  • Caracterizar o processo de construção da cassete de eliminação a partir de plasmídeos, recorrendo à técnica de amplificação por PCR.

Com o objectivo de exemplificar o uso da base de dados Saccharomyces Genome DatabaseLink externo (SGD) dedicada à levedura Saccharomyces cerevisiae seleccionou-se um problema biológico centrado na análise funcional do gene FLR1 (ORF YBR008c). Este gene foi assim denominado com base na sua capacidade para conferir à levedura resistência contra o importante fungicida de uso clínico fluconazole.

O gene FLR1 codifica uma proteína, presente na membrana plasmática, que pertence à família dos transportadores de múltiplas drogas da super-família de facilitadores maioritários (MFS, de Major Facilitator Superfamily, Sá-Correia e Tenreiro, 2002Link externo). Por isso, prevê-se que esta esteja a promover a expulsão activa, de dentro da célula, de compostos inibidores do crescimento, estruturalmente e funcionalmente não relacionados, num antiporte com protões, energizado pelo potencial electroquímico transmembranar.

Deste modo, a proteína FLR1p é responsável pela redução da concentração intracelular de fluconazole (e de vários outros compostos tóxicos), garantindo assim uma maior tolerância da levedura a estes compostos.

A eliminação do gene FLR1 do genoma de S. cerevisiae, por recurso a uma cassete de eliminação pressupõe a selecção de material biológico com base em ferramentas de bioinformática e a informação biológica disponível na SGD. Esse mutante Δflr1 pode depois ser usado para tentar esclarecer a função biológica do gene eliminado.

Foi com base em testes de susceptibilidade deste mutante a diversos compostos tóxicos que se demonstrou a sua função como determinante de resistência a alguns desses compostos.

Como DNA molde para PCR usou-se o plasmídeo pFA6-KanMX4 (Wach et al., 1994Link externo) que inclui a cassete de eliminação, KanMX4.

Mapa físico do plasmídeo pFA6-KanMX4

Fig. 1 - Esquema representativo do mapa físico do plasmídeo pFA6-KanMX4, usado como molde na reacção de PCR, realizada para obter as cassetes de eliminação SFH. Estão assinaladas as posições relativas dos iniciadores de PCR usados para proceder à verificação por PCR dos mutantes de eliminação.

Este módulo contém ainda o transposão Glossário Tn903 kanr de E. coli fundido com o promotor e o terminador do factor de elongação da tradução do fungo Ashbya gossypii (Ag TEF).

A expressão de KanMX4 confere resistência à canamicina em E. coli enquanto que em levedura (naturalmente resistente à canamicina) confere resistência a geneticina.

Autor e Créditos

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