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Detecção de proteínas, digitalização dos géis e análise dos proteomas Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

Detecção de proteínas por coloração com azul de Coomassie

  • Remover com cuidado os géis encastrados, após eliminação da zona acima da tira de focagem;
  • Colocar os géis nas tinas de coloração onde já deve existir cerca de 200ml de solução de fixação (30% etanol; 10% Ácido acético); deixar cerca de 2h;
  • Remover a solução de fixação e colocar cerca de 200ml de solução fresca de azul de Coomassie, previamente aquecido a cerca de 90ºC; deixar durante a noite (embora 1h seja habitualmente suficiente);
  • Remover a solução de azul de Coomassie, lavar com água destilada e adicionar  cerca de 200ml de solução de lavagem (10% Ácido acético); substituir a cada 2h até obter um gel com um fundo límpido e as manchas/proteínas nítidas; caso não se detectem as manchas convenientemente pode-se proceder a novo processo de coloração.

Digitalização dos géis

  • A secagem dos géis entre folhas de papel celofane faz-se após embeber os géis por cerca de 2h em solução de desidratação (35% Etanol; 2% Glicerol);
  • A digitalização dos géis é feita por um scanner apropriado para o efeito (por exemplo, pelo Image Scanner da Amersham Biosciences);

Análise comparativa de proteomas

  • A análise comparativa dos proteomas é feita por recurso a um software adequado (por exemplo o ImageMaster Platinum (v.5), da Amersham Biosciences), que permita realizar os seguintes passos:
  • Detecção dos manchas (spots);
  • Matching dos spots
  • Subtracção do resíduo de fundo (background)
  • Normalização;
  • Verificação da factualidade das diferenças apontadas, considerando que alguns factores podem levar em erro a leitura do programa.

Autor e Créditos

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