Detecção de proteínas, digitalização dos géis e análise dos proteomas Intermédio
Publicado em 18/11/2005
Detecção de proteínas por coloração com azul de Coomassie
Remover com cuidado os géis encastrados, após eliminação da zona acima da tira de focagem;
Colocar os géis nas tinas de coloração onde já deve existir cerca
de 200ml de solução de fixação (30% etanol; 10% Ácido acético); deixar
cerca de 2h;
Remover a solução de fixação e colocar cerca de 200ml de solução
fresca de azul de Coomassie, previamente aquecido a cerca de 90ºC;
deixar durante a noite (embora 1h seja habitualmente suficiente);
Remover a solução de azul de Coomassie, lavar com água destilada e
adicionar cerca de 200ml de solução de lavagem (10% Ácido
acético); substituir a cada 2h até obter um gel com um fundo límpido e
as manchas/proteínas nítidas; caso não se detectem as manchas
convenientemente pode-se proceder a novo processo de coloração.
Digitalização dos géis
A secagem dos géis entre folhas de papel celofane faz-se após
embeber os géis por cerca de 2h em solução de desidratação (35% Etanol;
2% Glicerol);
A digitalização dos géis é feita por um scanner apropriado para o efeito (por exemplo, pelo Image Scanner da Amersham Biosciences);
Análise comparativa de proteomas
A análise comparativa dos proteomas é feita por recurso
a um software adequado (por exemplo o ImageMaster Platinum (v.5),
da Amersham Biosciences), que permita realizar os seguintes passos:
Detecção dos manchas (spots);
Matching dos spots
Subtracção do resíduo de fundo (background)
Normalização;
Verificação da factualidade das diferenças
apontadas, considerando que alguns factores podem levar em erro a
leitura do programa.
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