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Separação por SDS-PAGE (2ª dimensão) Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

Preparação dos géis de poliacrilamida e corrida dos extractos focados (SDS-PAGE)

Preparação de géis de poliacrilamida para corrida em SDS-PAGE:

  1. Montar o suporte do gel após lavagem e secagem cuidadosa dos seus componentes;
  2. Preparação da mistura reaccional de polimerização da acrilamida: 123,75 ml de acrilamida 40%, 66ml bis-acrilamida 2%, 112.5ml de Tampão de resolução 4X (1.5M Tris-HCl; pH 8.8), 143.75ml de H2O desionizada; no final 4 ml de APS 10% (ammonium persulfate) e 150 μl de TEMED (N,N,N’,N’-TetraMethyl-EthyleneDiamine); misturar com agitação suave e introduzir lentamente (para evitar bolhas) no gel caster. Distribuir sobre cada gel 1ml de H2O desionizada e, passado cerca de 2h, cobrir os géis ainda em polimerização com tampão de corrida (Tris-Base 25mM; Glicina 192mM; SDS 0.1%). Deixar a polimerizar durante a noite;
  3. Preparar 6L de tampão de corrida e colocar 4L a termostatizar durante a noite na tina de electroforese;

Corrida dos extractos focados em géis de poliacrilamida (SDS-PAGE):

  1. Descongelar 150ml de tampão de equilíbrio (50mM Tris-HCl, pH8.8; 6M Ureia; 2% SDS; 30% glicerol; pós de azul de bromofenol) e dissolver 0.75g de DTT em 75 ml (10mg/ml) e 1.75g de iodoacetamida nos restantes 75ml (25mg/ml);
  2. Introduzir as tiras de focagem nos tubos de equilíbrio e adicionar a cada tubo 12.5ml de tampão de equilíbrio + DTT; mantêr sob agitação suave durante 15min;
    EDD 6
  3. Retirar a solução de equilíbrio e adicionar a cada tubo 12.5ml de tampão de equilíbrio + iodoacetamida; mantêr sob agitação suave durante 15min;
  4. Desmontar o gel caster e colocar os geis num suporte, garantindo que a superfície do gel se mantém submersa em tampão;
  5. Colocar a tira de focagem em contacto com a parte superior do gel, colocar numa das extremidades um dente de plástico para permitir a formação de um poço e selar tudo com uma solução de agarose 0.5%, preparada em tampão de corrida, com uns pós de azul de bromofenol;
  6. Introduzir os géis na tina de electroforese; montar as restantes peças da tina e perfazer o volume recomendado de tampão de corrida;
  7. Aplicar uma tensão inicial de 15W durante 30 min seguida de uma tensão de 100W durante 4,5h;

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