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Focagem isoeléctrica (1ª dimensão) Intermédio

Publicado em 18/11/2005 

Focagem isoeléctrica

EDD 4
  • Descongelar 6 tiras de poliacrilamida IPG strip com gradiente de pH entre 4 e 7;
  • Centrifugar as amostras proteicas resuspensas no tampão de re-hidratação durante 5 min, 15000 rpm e à temperatura ambiente;
  • Recolher o sobrenadante para um novo tubo de eppendorf e aplicá-lo nosarcófago onde ocorrerá a focagem isoeléctrica; pipetar a amostra de forma a cobrir todo o fundo do sarcófago;
  • Remover a película protectora da tira de acrilamida e colocar a tira, com o gel virado para baixo, com o extremo da tira voltado para o eléctrodo positivo e garantindo a sua humidificação total; remover bolhas de ar que tenham ficado entre o fundo do sarcófago e a tira de acrilamida;
  • Aplicar cuidadosamente 3ml de DryStrip Cover Fluid ao longo de toda a tira;
  • Colocar a tampa do sarcófago e alinhar os 6 sarcófagos na unidade de focagem isoeléctrica.
    EDD 5
  • Programar a unidade de focagem com o seguinte programa típico: 2h 0V; 12h 30V; 1h 200V; 1h 500V; 1h 1000V; 1h 1000V-8000V; 6h 8000V.

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