Preparação e quantificação de extractos proteicos Intermédio
Publicado em 18/11/2005
Preparação de extractos proteicos
Lavar (para lavar devem-se centrifugar as células durante 5
minutos à velocidade de 10000rpm e 4ºC, descartando no
final o sobrenadante) duas vezes o material biológico de partida
(pellet de células microbianas) com tampão 10 mM Tris base
A lise celular de bactérias será efectuada por uso de ultrassons. Após descongelar, o sedimento
celular é resuspenso em 1ml de tampão de lise (10mM Tris
base) e a suspensão celular resultante é sujeita a 15s de sonicação,
seguidos de 1 min de repouso. Este processo é repetido 6 vezes. A
suspensão de células lisadas é, em seguida, centrifugada durante
10 min a 6000 rpm e a 4ºC, para separar a solução proteica do sedimento
contendo o debris celular. O sobrenadante, que corresponde ao extracto
proteico, é transferido para novo tubo e guardado no gelo.
A lise celular das células de levedura será efectuada por ruptura
mecânica. Ao sedimentode células adiciona-se igual volume de esferas de
vidro (por exemplo Glass Beads; 425-600 μm; Sigma) e 500 μl de tampão
de lise (10mM Tris-Base; Inibidores de proteases: (10μg/ml leupeptina;
1μg/ml pepstatina A; 20μg/ml aprotinina; 2μg/ml inibidor de
tripsina/quimotripsina; 1.5μg/ml benzamidina; 1mM fluoreto de
fenilmetilsulfonilo (PMSF)). Cada tubo é agitado num
vortéx durante 30s e seguidamente colocado 30 s no gelo, sendo
este processo repetido ao longo de 8 min. Em seguida, a mistura é
colocada no gelo por 10 min e centrifugada 15 min, a 15000rpm e 4ºC,
sendo o sobrenadante - o extracto proteico bruto - transferido para um
novo tubo e guardado em gelo.
Para eliminar ou reduzir a quantidade de contaminantes
precipita-se, selectivamente, as proteínas presentes nos extractos
brutos, usando um kit comercial (por exemplo o 2-D Clean Up kit, da Amersham Biosciences) seguindo as instruções do fabricante;
Dissolvem-se os extractos proteicos em tampão de re-hidratação: 8 M
ureia, 15 mM DTT, 2% CHAPS, 0.5% anfólitos (ex. Pharmalytes 3-10,
Amersham Biosciences) e uns pós de azul de bromofenol. Deixa-se a
solução durante 1h à temperatura ambiente para favorecer a
ressupensão.
Quantificação dos extractos proteicos
A quantificação da proteína total nos extractos é feita usando um kit comercial (por exemplo, o 2D Quant kit, da Amersham Biosciences) seguindo as instruções do fabricante;
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