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Preparação de DNA recombinado Básico

Publicado em 18/11/2005 

A tecnologia do DNA recombinado (rDNA) envolve vários passos cujo objectivo final é fazer a ligação de um fragmento de DNA, por exemplo de um gene a um vector de clonagem, formando uma molécula de DNA recombinado (rDNA).

O primeiro passo na estratégia de clonagem consiste na abertura do vector de clonagem onde se pretende introduzir o fragmento de DNA de interesse, e na preparação desse mesmo fragmento, de modo a permitir esta ligação. Esta etapa consiste na aplicação de enzimas de restrição sobre o vector de clonagem e sobre a molécula de DNA da qual queremos destacar o fragmento ou gene para clonagem, de modo a gerar extremidades compatíveis para ligação. Isto é facilitado pela aplicação da mesma enzima de restrição sobre as duas moléculas a ligar.

Sempre que possível usam-se enzimas de restrição que originem extremidades coesivas em detrimento de enzimas que originam extremidades cegas, uma vez que as primeiras facilitam o processo de clonagem.

Utilização de enzimas de restrição no processo de preparação de DNA recombinado para clonagem in vitro.

Após preparação das duas moléculas de DNA que se pretendem recombinar in vitro, ou seja, no tubo de ensaio, segue-se o processo de ligação. Caso o vector de clonagem e o fragmento de DNA a clonar tenham sido tratados com a mesma enzima de restrição, as suas extremidades (em grande parte dos casos coesivas) serão compatíveis, possibilitando o emparelhamento entre bases complementares por ligações de hidrogénio.

Há ainda que promover a ligação covalente (uma ligação fosfodiéster) entre os dois nucleótidos das extremidades das duas moléculas a ligar. Para tal, usa-se uma enzima chamada DNA ligase, que catalisa a ligação entre o grupo fosfato ligado ao carbono 5’ e o grupo hidroxilo ligado ao carbono 3’ das moléculas de desoxiribose presentes nos nucleótidos que constituem o DNA, numa reacção que para se dar necessita de ATPGlossário.

Reacção de ligação do fragmento de DNA a clonar ao vector de clonagem catalisada pela enzima DNA ligase.

Neste passo, pode acontecer que o vector de clonagem recircularize (ligação intermolecular) em vez de haver integração do fragmento de DNA a clonar, voltando o processo ao início. Podem ainda formar-se dímeros do vector sem ligação do fragmento de DNA. Existe, no entanto, uma técnica que faz uso da enzima fosfatase alcalina que minimiza o problema da recircularização do vector de clonagem.

A etapa seguinte consiste na introdução das moléculas de DNA recombinado (rDNA) (vector com o DNA exógeno clonado) num hospedeiro adequado que a transmita às gerações celulares seguintes, ou seja na transformação das células hospedeiras. De entre as colónias de células hospedeiras (normalmente mutantes apropriados da espécie bacteriana mais explorada como hospedeira em tecnologia de rDNA, Escherichia coli) transformadas com o vector recombinado é necessário conseguir seleccionar aquelas que contêm, de facto, o rDNA de interesse, excluindo assim as colónias que, ou não contêm o vector, ou contêm o vector “vazio” (ou seja, o vector que recircularizou sem incorporação do fragmento de DNA de interesse), através do processo de selecção de células com rDNA (recombinantes).

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