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Enzimas de restrição Básico

Publicado em 18/11/2005 

Em Engenharia Genética, a obtenção dos fragmentos de DNA que se pretende usar para criar, in vitro (em tubo de ensaio ou no laboratório) novas moléculas, baseia-se no uso das enzimas de restrição, que funcionam como "tesouras" capazes de clivar o DNA com precisão. Estas enzimas são endonucleases, ou seja, no interior (daí o prefixo endo-) das moléculas de DNA, cortando-as em locais bem definidos.

Foi a descoberta  destas enzimas, no início dos anos 70 do século XX, que, juntamente com a exploração da sua actividade e comercialização, permitiu o rápido desenvolvimento da Engenharia Genética. Hoje em dia conhecem-se centenas de enzimas de restriçãoTooltip isoladas de numerosas bactérias, estando o nome da enzima relacionado com o organismo de onde esta foi isolada e associado à especificidade da sequência de DNA em cadeia dupla que reconhece bem como aos locais em que dentro dessa sequência, procede à sua separação.

As enzimas de restrição reconhecem e actuam sobre sequências específicas de DNA, catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos ligados a determinadas bases. Os nucleótidos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise, encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento (como se pode observar na animação seguinte).

As diferentes enzimas de restrição diferem entre si em termos da sua especificidade no que respeita à natureza e extensão da sequência de nucleóticos de reconhecimento, e à forma como cortam o DNA alvo. Assim, podem reconhecer sequências específicas de quatro, seis ou oito pares de nucleótidos, presentes no DNA em cadeia dupla, cortando no interior dessas sequências. Um corte num fragmento de DNA por uma enzima de restrição gera dois fragmentos, podendo as extremidades resultantes desse corte ser de dois tipos: coesivas ou cegas (como se exemplifica na animação seguinte).

 As extremidades coesivas apresentam um pequeno número de nucleótidos em cadeia simples, capazes de se associar por ligações por pontes de hidrogénio, com outra cadeia simples em que a sequência de bases seja complementar desta. Ou seja, as duas extremidades coesivas a ligar terão de ser compatíveis, o que se sucede se os dois fragmentos a ligar  resultarem de uma reacção de restrição com uma mesma enzima (consultar Preparação de DNA recombinado). Os fragmentos de DNA com extremidades cegas, ainda que compatíveis com outros com extremidades cegas resultantes da acção de qualquer enzima de restrição que as gere, não possuem a capacidade de estabelecer entre si pontes de hidrogénio por complementariedade de bases. Desta forma, a ligação de dois fragmentos deste tipo quando em baixa concentração é muito mais difícil que a ligação de dois fragmentos com extremidades coesivas.

No contexto da Engenharia Genética, a grande utilidade das enzimas de restrição resulta do facto de poderem ser aplicadas sobre moléculas de DNA das quais se pretenda retirar um determinado fragmento (um gene, por exemplo) para posterior ligação a uma outra molécula de DNA, em particular a um vector de clonagem. Estas possibilitam ainda a abertura dos vectores de clonagem que irão integrar esse mesmo fragmento de interesse. Em suma, as enzimas de restrição, viabilizam a formação de moléculas de DNA recombinado por permitirem criar fragmentos, com a informação genética de interesse, capazes de virem a ser ligados por recurso a enzimas que catalisam a formação da ligação covalente de dois fragmentos de DNA, as ligases.

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