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Electroforese de proteínas nativas Básico

Publicado em 18/11/2005 

Electroforese de proteínas nativas - Procedimento experimental

Preparação das amostras

As amostras são preparadas de forma similar ao descrito na técnica de SDS-PAGE (ver). A diferença reside no tampão a utilizar. Este pode ter a seguinte constituição: Imidazole 20 mM (Sigma), EDTA 2mM (Sigma), pH 7,0; ou alternativamente: Tris-HCl 25mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM, pH 7,5.

Preparação do gel de poliacrilamida

  • Após a montagem do sistema de preparação de geís, descrito na técnica de SDS-PAGE (ver), preparar o gel de resolução (10% de acrilamida), juntando:
    • 0,375 ml de solução I (ver composição), sem SDS;
    • 1,25 ml de solução de acrilamida (ver composição);
    • 2,0375 ml de água destilada;
    • 6,25 µl de TEMED;
    • 25 µl de persulfato de amónia 10%.
    • Misturar cuidadosamente e pipetar imediatamente a solução entre as placas de vidro e silica até uma altura de aproximadamente 6 cm. Colocar uma camada de 1 ml de isopropanol de forma a obter uma superfície plana. Deixar polimerizar.
  • Após polimerização remover o isopropanol com papel absorvente.
  • Preparar o gel de concentração (6% de acrilamida) juntando:
    • 0,4 ml de solução II (ver composição), sem SDS;
    • 0,4 ml de solução de acrilamida;
    • 1,2 ml de água destilada;
    • 4 µl de TEMED;
    • 12 µl de persulfato de amónia 10%.
  • Misturar cuidadosamente, encher o espaço entre as placas com esta solução e colocar o pente. Deixar polimerizar.

Autor e Créditos

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