Técnica de SDS-PAGE Básico
Publicado em 18/11/2005
SDS-PAGE - Procedimento experimental
Preparação das amostras
Recolher uma amostra de uma cultura de E. coli (volume equivalente
a 1,2/DO600nm
da cultura), centrifugar e ressuspender as células em 80 µl de
tampão de aplicação em SDS-PAGE (ver composição).
Colocar as amostras no gelo. Ferver todas as amostras durante 5 min e guardar
a –20ºC até utilização posterior.
No caso da levedura S. cerevisiae recolher um volume igual a 20/DO600nm da cultura, centrifugar e congelar o pellet a -20ºC até utilização posterior.
- Lise das células de batéria por recurso a ultrassons:
A lise celular é efectuada por uso de ultrassons (por exemplo com um sonicador Vibracel). Após descongelar, o tubo contendo a suspensão celular é mantido em gelo e esta é sujeita a 30s de sonicação a 70Watts, seguidos de 1 min de repouso. Este processo é repetido 3 vezes. A suspensão de células lisadas é, de seguida, centrifugada durante 45 min a 15000 rpm e a 4ºC, para separar a solução proteica do sedimento contendo o debris celular. O sobrenadante, que corresponde ao extracto proteico, é transferido para novo tubo e guardado no gelo.
- Lise das células de levedura por recurso a esferas de
vidro:
A lise celular é, neste caso, efectuada mecanicamente. Ao pellet de células adiciona-se igual volume de esferas de vidro (por exemplo Glass Beads; 425-600 µm; Sigma) e 100 µl de tampão de aplicação em SDS-PAGE (ver composição). Cada tubo é agitado num vortéx por 30s e seguidamente colocado 30s no gelo, sendo este processo repetido ao longo de 8min. Após 10min de repouso no gelo, a mistura é centrifugada 15 min, a 15000 rpm e 4ºC, sendo o sobrenadante - o extracto proteico bruto - transferido para um novo tubo e guardado no gelo.
O tampão a utilizar no processo de extração pode variar de acordo com o que se pretende fazer após a extracção. Em todos os casos, porém, deverá conter inibidores de proteases, uma vez que as proteases existentes nas células a lisar poderão degradar as proteínas da amostra.
A mistura de inibidores de proteases poderá ser 100 ml A+B+C; 20ml D para um total de 2ml de tampão de lise. As soluções stock de inibidores de proteases, a armazenar a -20ºC apresentam as seguintes composições:
- Sol. A - Leupeptina - 1mg/ml em DMSO (Dimethyl Sulfoxide);
- Sol. B - Pepstatina A - 1mg/ml em DMSO;
- Sol. C - Aprotimina 2 mg/ml; Benzamidina 150 mg/ml; Inibidor de Tripsina/Quimiotripsina 200 mg/ml; EDTA 5mM em água destilada;
- Sol. A+B+C: 200 ml A + 20 ml B + 200 ml C + 580 ml H2O.
- Sol. D – PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 100mM em DMSO.
Resultados de SDS-PAGE de extractos proteicos obtidos na ausência e presença de inibidores de protease (ver).
Após obtenção dos extractos proteicos brutos, dever-se-á proceder à quantificação da proteína total em cada amostra, caso se queira aplicar igual quantidade de amostra nos vários poços do gel.
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